PCR em tempo real e SARS-CoV-2

por Miguel Gaspar*

A sequenciação completa do novo Coronavírus a 29 de janeiro de 2020 pelo Institut Pasteur abriu uma nova porta para a sua identificação e posterior acompanhamento da evolução de casos pelo mundo. Os Coronavírus são vírus de RNA (informação genética de cadeia única) que tanto podem infetar humanos como outras espécies, provocando geralmente sintomas respiratórios. Sendo o SARS-CoV-2 recente na família dos Coronavírus, desvendar a sua sequência genómica foi importante para determinar testes de diagnósticos eficazes. Um deles é a RT-PCR, do inglês Real Time Polymerase Chain Reaction. Cada vez que alguém diz que vai fazer o teste, provavelmente é a este que se refere: a famosa zaragatoa que nos cumprimenta, ansiosa pela amostra que irá para o laboratório. Mas o que acontece lá? O que é um RT-PCR?

Assumindo que a amostra da zaragatoa continha realmente SARS-CoV-2, ou seja, que a pessoa em questão é portadora do vírus e pode padecer de COVID-19 (com ou sem sintomas), a RT-PCR indica, em tempo real, a quantidade viral da mesma.

Para realizar este teste, temos de ter várias informações em conta:

  • Identificar uma região específica do código genético do vírus e criar uma sequência complementar (primer – uma sequência que se liga complementarmente ao vírus), para permitir a duplicação desta sequência, usando também outros componentes que permitem essa ação;
  • Transformar RNA em DNA e arranjar primers para amplificação do vírus: a informação genética do coronavírus é RNA (ácido ribonucleico), mas para realizarmos a RT-PCR precisamos de DNA (ácido desoxirribonucleico de cadeia dupla), portanto temos de criar o que se chama de cDNA (DNA complementar, tornar o RNA do vírus em DNA para o teste). Tudo isto para uma amostra de uma pessoa!

Preparada a amostra para o teste, fica então a questão: mas como é que faço para duplicar a sequência do vírus que veio da zaragatoa? Aqui sim, começa o teste RT-PCR.

Tendo transformado RNA em cDNA, e juntado a este todos os ingredientes necessários para o teste em tubos, procedemos ao teste, que se baseia em variações cíclicas de temperatura, que favorecem a ação otimizada de proteínas: o aumento de temperatura faz com que o cDNA quebre a sua cadeia dupla. Isto faz com que agora tenhamos duas cadeias de DNA sem par. Seguidamente dá-se a ligação do primer (aquela sequência complementar à sequência genómica do vírus) ao DNA, a uma temperatura inferior. Depois DNA polimerase, estável a temperaturas mais elevadas, começa a sua ação de criar uma cadeia de DNA complementar à do vírus aquando um novo aumento da temperatura. Assim, a partir de uma cadeia de cDNA obtemos duas! E como o teste é cíclico, de duas passamos a quatro cadeias, oito, etc.

Este é o processo de duplicação da informação que tínhamos na nossa amostra inicial. Mas o teste vai mais além; através da utilização de corante fluorescente que se liga a duplas cadeias de DNA, podemos verificar quanto material genético temos ao final de cada ciclo! Isto é fulcral para a interpretação de resultados, porque quanto mais material genético tivermos na amostra inicial, menos ciclos precisamos para obter um valor elevado de quantidade viral. É esta análise em tempo real que torna o teste muito preciso, de confiança e fundamental no rastreio de cadeias de transmissão.

*Licenciado em Biologia e Mestre em Biologia Molecular e Genética, trabalha agora em Évora, no Hospital do Espírito Santo, em Projetos Europeus. Nos tempos livres gosta de ler, introspeção, Filosofia e neste momento está numa demanda para aprender a tocar baixo. Gosta de viajar, de fotografia e sonha um dia voltar a Florença e ter uma coleção de vinis

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